Faire cristalliser une protéine pour l'observer

aux rayons X (parce que c'est classe)

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Auteur du sujet

Bonjour tout le monde !

Je vous passe le couplet sur les révisions pendant les vacances ; mon problème est que j'ai de gros doutes sur les conditions expérimentales de cristallisation et observation d'une protéine cristallisée. Je vais pondre un baratin juste en dessous correspondant à ce que j'ai retenu, en espérant ne rien omettre (et c'est là où vous pourrez intervenir si possible, surtout en ce qui concerne le protocole expérimental).

Pour observer une prot aux rayons X (afin d'avoir une résolution de l'ordre de qqs Angstroms), on commence par en faire un cristal afin d'amplifier le signal. Un cristal est une répétition d'unité élémentaire, la maille, et de façon hhautement organisée. On va pouvoir faire apparaître des interférences, constructives et destructives, comme en optique classique et augmenter l'intensité du signal.

Pour cristalliser, on commence par solubiliser la protéine en concentration de l'ordre du µg par µL (?) et on augmente la concentration par diffusion de solvant (eau) ; si tout se passe bien un cristal apparaît ; on le bombarde de rayons X qui interfèrent avec les électrons et dévient ainsi le faisceau. Quand tout arrive sur la plaque de détection, on récupère le signal obtenu, avec les interférences. Pour une raison qui m'est inconnue, ce qu'on a correspond à une transformée de Fourier, amplitude (en fonction de la position ?). On connaît la fréquence des RX qui traversent le signal, on récupère l'amplitude mais on a perdu l'information de phase de l'onde, il nous manque donc une info caractéristique.

Pour récupérer cette info, soit on compare ensuite à une protéine très similaire déjà résolue en en prenant la transfo de Fourier et en se servant comme base pour reconstruire le signal par transfo inverse, soit on a fait placer dans le cristal des atomes lourds (donc riches en électrons donc marques caractéristiques) qui vont permettre de reconstruire ensuite l'image… Ça nous donne une carte de densité électronique. Pour peu que le signal soit suffisamment fin (donc forte dose de rayonns X + cristal suffisamment grand pour amplifier correctement), on a la structure atomique.

Enfin, pour estimer la résolution qu'on a, on compare le modèle calculé aux résultats : on prend la transfo de Fourier du modèle, le signal qu'on a et on calcule le taux de similitude. Je sais vaguement qu'on doit l'exprimer en fonction d'une distance (ou l'inverse d'une distance) et qu'on dit que la résolution correspond à la valeur pour laquelle on a 50% de similitude.

Mon seul problème est que je trouve que ça fait très magie-abracadabra et j'ai du mal à dêmeler les pinceaux. D'où lle fait que je vous demande de critiquer chaque point qui soit faux/inexact/un peu trop magique.

Avec mes meilleurs voeux pour les fêtes à venir.

Ich bin très occupé cette année. Ne vous étonnez pas si je réponds par intermittence.

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De loin ça me semble bon, mais la biochimie n'est pas vraiment mon domaine. Donc pour les critères utilisés et autres, je ne peut pas vraiment aider.

Pour une raison qui m'est inconnue, ce qu'on a correspond à une transformée de Fourier, amplitude (en fonction de la position ?).

Ça, ça vient de la loi de Bragg: si tu calcule les interférences sur un réseau infini et périodique, tu te rends compte que tu récupère la transformée de Fourier spatiale de ce réseau.

Mon Github — Tuto Homebrew — Article Julia

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Bon, c'est pas mon domaine, c'est celui du labo d'à coté, donc mes connaissances (que j'ai eu en cours il y à 2 ans) sont plus très fraîches, mais voici un ou deux trucs donc je me souviens.

Pour ce qui est de la cristallisation de la protéine, c'est hyper-chaud. Je sais que ça implique souvent de la cristalliser avec un ligand ou un sel, la raison invoquée étant que ça rend la protéine plus rigide, donc plus facile à cristalliser. Du coup, ça donne lieu à deux méthodes aux noms rigolos, la méthode hanging drop et sitting drop, la méthode de la goutte "pendante" et "assise" (je fais pas de la pub pour "Hampton search", évidement, c'est juste que Google me donne ça en premier). On se base simplement sur de la diffusion pour éliminer l'eau petit à petit et ainsi donner le temps à la protéine de se cristalliser.

N'oublie pas non plus plusieurs choses : pour commencer on ne "voit" pas les hydrogènes en DRX, parce que leur densité électronique est beaucoup trop "faible". Du coup, les cristallographes "ajoutent" les hydrogènes à posteriori (de manière plus ou moins intelligente). Raison pour laquelle les pont hydrogènes dans les protéines ne sont pas défini à partir de la distance hydrogène-accepteur, mais donneur-accepteur. Par ailleurs, il y a toujours de la densité électronique "résiduelle" dont on ne sais pas trop quoi faire, du coup on met des molécules d'eau dedans ;)

Doctorant et assistant en chimie à l'Université de NamurEx-dev' pour ZdS (a aidé à réaliser la ZEP-12 !) • Carniste cis (y parait que c'est une injure)

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Auteur du sujet

Merci pour vos réponses.

@Luthaf : d'accord, merci pour l'info ! En revanche je vais être franc, je ne connais pas grand chose en ce qui concerne les cristaux et la transfo de Fourier, donc je vais te croire sur paroles, mais ça me donne une idée de ce qui se passe ^^

@pierre : Oki doki, ce que tu dis fait écho à des trucs que j'avais oublié et complète aussi.

Dans l'ensemble, rien ne paraît choquant ? Je vous présente mes excuses pour ce côté lourdingue mais c'est un cours à la limite de mes connaissances donc je bute parfois, en ayant l'impression de patauger dans une explication +/- vaseuse parfois.

(De ce que j'ai compris, pour vérifier, quand on observe en MET par contre, les « lentilles magnétiques » font office de transfo inverse "mécanique" et on récupère ensuite directement la micrographie ?). Et toujours pour le calcul de résolution, quand on exprime le pourcentage de similitude entre le signal observé et le signal qu'a le produit reconstruit en fonction d'une distance, cette distance c'est le "taux de finesse" qu'on prend pour évaluer les similitudes ?

Ich bin très occupé cette année. Ne vous étonnez pas si je réponds par intermittence.

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