PCR sur des petits vers

Bonjour tout le monde,

j'ouvre ce sujet pour un point très technique qui me pose problème. Habituellement pour une PCR je n'ai jamais eu de problèmes mais ça fait quelques temps qu'elles foirent lamentablement les unes après les autres, entre les contrôles positifs qui n'ont aucune bande et les échantillons qui ont des smears qui recoupent toute la distance de migration. À tout hasard, entre toutes mes tentatives pour corriger le problème, je me demandais si quelqu'un ici avait déjà travaillé sur des vers, avait eu des trucs dans le genre et connaîtrait une astuce. Voici un peu plus d'infos :

Je dois travailler sur un seul ver (pour être sûr d'avoir une lignée génétique pure et ne pas risquer de tomber sur un homozygote positif alors que la population générale sur la plaque est hétérozygote). Le fragment à amplifier fait environ 800, 850 pb. Pour chaque échantillon, le ver est placé dans un tampon à 10 mM Tris pH 8, 2 mM MgCl2, 50mM KCl, 0.5% Tween 20 (2µL). Puis le ver est congelé à l'azote liquide pour casser la cuticule. Je rajoute 3µL pour une concentration finale de 60 µg/mL protéinase K, chauffage à 60°C 1h, puis 94°C 15 min pour la détruire.

Je rajoute ensuite le mélange réactionnel pour un volume final de 50µL, à 1µM de chaque primer, 0.2 mM de dNTP, 1X de tampon enzymatique commercial et l'enzyme Taq pol. Chaque cycle de PCR fait 30 sec à 94°C pour dénaturer, 30 sec à température d'appariement des primers avec l'ADN et 2 min à 72°C pour polymériser. À la toute fin, 72°C pendant 10 min.

Sauriez-vous me dire si ça vous paraît correct ou si vous avez des astuces pour des PCR sur ver (et si jamais vous ne savez pas merci tout de même d'avoir lu !) ; au labo personne ne sait pourquoi ça rate, peut-être aurais-je plus de chances par ici ?

J'arrive un peut tard et c'est pas du tout mon domaine, mais il me semble que l'acide humique est un inhibiteur de la Taq et qu'on en trouve dans les vers :S

Un moyen de limiter cela serait de diluer l'extrait jusqu'à ce que la concentration en acide humique soit trop basse pour entrainer une inhibition de l'enzyme, mais ça va aussi réduire l'amplification de ta PCR :/

Autres méthodes : chromato d’exclusion et/ou filtration sur gel, chélation par protéine ou EDTA.

Sinon, il doit exister des enzymes résistantes à l'inhibition, KlenTaq chez sigma par exemple.

Après, la biochimie ça me dépasse complétement, ça serais bien que quelqu’un puisse valider même si le post est vieux d'un mois.

Ah merci beaucoup pour ta réponse, je n'espérais plus grand chose de ce sujet (j'en avais même oublié que je l'avais écrit !). C'est toujours bon à prendre pour info ; en revanche j'ai quitté le projet depuis –> retour aux études, impossible de tester quoi que ce soit (et on s'était débrouillé pour faire autrement, la situation ne s'était pas débloquée). Merci beaucoup tout de même, je passe en résolu (même si du coup ça ne l'est pas mais comme je peux plus rien tester, je pourrai pas dire).

Pour voir si c'est vraiment ça il faudrait voir si le CT de ton gène de référence augmente. Mais c'est valable uniquement si les concentrations en acide humique varient entre les différentes conditions, sinon ça ne se verra pas. Et il faut que le traitement n'influe pas sur le gène de référence.

C'est vrai que c'est comme ça qu'il aura fallu tester l'hypothèse mais je pourrai pas vous dire si ça marche ou non, stage terminé. Merci encore, c'est noté dans un coin de la tête et peut-être que ça servira à qqn plus tard si le problème se répète.